用于成骨的新型納米振動生物反應器的設計 構(gòu)建和表征

在再生醫(yī)學中，科學家們的目標是顯著推進可以控制干細胞譜系承諾的技術(shù)。例如，納米尺度的間充質(zhì)干細胞(MSC)的機械刺激可以激活機械轉(zhuǎn)導途徑以刺激2-D和3-D培養(yǎng)物中的骨生成(骨發(fā)育)。這種工作可以通過從自體或同種異體中產(chǎn)生移植材料來徹底改變骨移植手術(shù)MSCs的來源沒有化學誘導這種現(xiàn)象。由于對臨床使用的細胞的這種機械刺激的生物醫(yī)學興趣的增加，研究人員和臨床醫(yī)生都需要可擴展的生物反應器系統(tǒng)以提供始終可重復的結(jié)果。在現(xiàn)在發(fā)表在科學報告上的一項新研究中，Paul Campsie和生物醫(yī)學工程，計算，物理和分子，細胞和系統(tǒng)生物學系的多學科研究人員團隊設計了一種新的生物反應器系統(tǒng)，以滿足現(xiàn)有的要求。

新儀器包含一個用于生物反應的振動板，校準和優(yōu)化1 kHz的納米振動，一個產(chǎn)生30 nm振幅的電源單元和用于細胞生長的定制六孔培養(yǎng)器皿。培養(yǎng)皿包含磁性插入物，用于連接生物反應器的磁振板。他們評估了成骨蛋白的表達，以確認在系統(tǒng)內(nèi)的初始生物實驗后MSC的分化。Campsie等人。進行3-D凝膠構(gòu)造的原子力顯微鏡(AFM)以驗證在振動刺激期間不發(fā)生凝膠的應變硬化。結(jié)果證實細胞分化是僅由生物反應器提供的納米振動刺激的結(jié)果。

由于與骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎等年齡相關(guān)的病癥引起的骨骼損傷的發(fā)生率增加是人類生命消耗質(zhì)量的衡量標準。增加骨密度或骨折愈合的治療方法的發(fā)展是間充質(zhì)干細胞(MSC)再生潛能的主要目標。研究人員已經(jīng)證明了使用幾種方法(包括被動和主動策略)通過機械刺激控制骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨(骨骼發(fā)育)。被動方法通常改變基底形貌以影響細胞粘附特征，而主動方法包括暴露于來自外部來源的各種力。

在ANSYS工作臺17.1中進行有限元分析，以確定十三和十五壓電陣列頂板布置上1kHz的諧波響應。(A)十三個壓電陣列圖。(B)十五個壓電陣列圖。(C)在1kHz下預測十三個壓電陣列的納米級位移。(D)在1kHz下預測十五個壓電陣列的納米級位移。圖片來源：科學報告，doi：10.1038 / s41598-019-49422-4。

Campsie等人目前的工作。打算在MSC的受控骨生成的預先存在的設計上取得進展，以構(gòu)建適用于小規(guī)模臨床試驗的良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)兼容系統(tǒng)。在建造時，該團隊使用激光干涉儀精確測量生物反應器頂板和用于培養(yǎng)器皿的井內(nèi)的振動位移，以驗證他們基于有限元分析(FEA)模型開發(fā)的設備。該團隊使用直接數(shù)字合成波形 (DDS)發(fā)生器和重建濾波器，用于去除DDS輸出的高頻分量，從而產(chǎn)生1 kHZ的純正弦波輸出，以實現(xiàn)精確的納米振動。

研究小組通過進行生物實驗來量化生物反應器系統(tǒng)的運行，以量化暴露于納米振動刺激的MSC的成骨蛋白表達。他們對實驗中使用的膠原凝膠進行了AFM測量，以確定從培養(yǎng)皿傳遞到凝膠中的振動。然后他們表明，凝膠的剛度對于發(fā)生的納米振動沒有顯著增加。

不同劑量的等離子體處理后的PP培養(yǎng)器皿的水接觸角測量和在PP和聚苯乙烯(PS)6孔板上的MG63細胞(成骨細胞)的顯微鏡圖像。等離子體處理(A)后的WCA測量曲線顯示，需要至少30秒才能將WCA顯著改變至允許細胞粘附和增殖的水平。(B)血漿處理前PP63孔板上MG63細胞不粘附的圖像，(C)血漿處理的PP6孔板上MG63細胞的粘附和增殖，和(D)標準培養(yǎng)的MG63細胞康寧PS 6孔板。圖片來源：科學報告，doi：10.1038 / s41598-019-49422-4。

Campsie等人。構(gòu)建了具有特定材料選擇和培養(yǎng)器附件的生物反應器，以在1Hz和5kHz的頻率之間提供最佳的納米級振動。它們確保裝置的共振頻率遠高于操作頻率，以防止共振放大或阻尼。為了確定設備的適當尺寸，研究團隊使用ANSYS Workbench軟件執(zhí)行了FEA ?？茖W家通過使用13到15個壓電陣列以低成本創(chuàng)造了生物反應器為了它的建設。產(chǎn)品設計允許細胞的最小和最大位移的不同交替帶，以在整個培養(yǎng)器皿中接收不一致的振動水平。該團隊估計了壓電致動器和其他設備組件的固有共振頻率，以了解它們對實驗裝置的影響。

然后，研究小組使用等離子體表面活化來改變塑料培養(yǎng)器皿的表面化學，以幫助細胞粘附和增殖，從而增加聚合物的表面能。在空氣等離子體處理五分鐘后，他們培養(yǎng)人類成骨細胞樣細胞以觀察細胞與培養(yǎng)器皿的附著增加。他們測量了聚合物的水接觸角，以確定改性的表面能和表面潤濕性?？茖W家們展示了聚合物培養(yǎng)皿等離子體活化的原理驗證及其對有利細胞附著的表面潤濕性的影響。他們的目標是進一步開發(fā)培養(yǎng)皿表面，以確保其穩(wěn)定性和保質(zhì)期。

TOP：生物反應器振動板，注塑成型PP 6孔培養(yǎng)皿。(A)改進型生物反應器具有較輕的底座，提手和凹底板，以及設計用于輸出1 kHz和30 nm位移幅度的正弦波的電源。(B)注射成型的PP培養(yǎng)器皿，在每個孔的底部裝有halbach鐵氧體環(huán)形磁鐵?？蚣芎涂妆诘暮穸葹?.5毫米。BOTTOM：干涉儀測量設置和輸出信號。(A)為了測量納米級位移，干涉儀發(fā)射來自激光頭的激光束，該激光束被反射回被測物體上的光電探測器(也在激光頭內(nèi))。對產(chǎn)生的光學干涉圖案的分析允許獲得位移。(B)由干涉儀測量的時間序列數(shù)據(jù)的示例。(C)時間序列數(shù)據(jù)的FFT分析示例?？汕宄乜吹缴锓磻鞯?kHz峰值，并且在750Hz處也存在大的峰值，然而，該信號由干涉儀的參考鏡產(chǎn)生，該參考鏡在固定頻率下恒定激發(fā)以獲得控制信號。圖片來源：科學報告，doi：10.1038 / s41598-019-49422-4。

研究團隊在目前的工作中顯著改進了生物反應器的設計，與之前提出的原型相比，形成了更輕的基礎(chǔ)。他們使用AD9833電源波形發(fā)生器進行電源調(diào)節(jié)，并且可以輕松調(diào)節(jié)并保持適當?shù)臑V波，以獲得純1 kHz正弦波驅(qū)動信號。研究人員獲得了濾波前和濾波后信號的功率譜，以估算發(fā)生器的功率譜密度。他們使用激光干涉儀驗證了生物反應器的FEA建模和校準，以確定位移的納米級變化?？茖W家們使用粘合在每個井底面的棱柱形反射帶來測量與生物反應器磁性連接的培養(yǎng)皿孔尺寸。

該技術(shù)具有巨大的空間，可以從接種在膠原凝膠中的MSCs中生成三維礦化基質(zhì)，形成骨骼支架。例如，培養(yǎng)的細胞在振動期間接受周期性加速力，其作用于細胞膜和細胞骨架以誘導骨生成。該效應還可能與細胞培養(yǎng)基中的環(huán)境剛度有關(guān)，影響干細胞分化并誘導MSC中的骨生成。為了區(qū)分原因，Campsie等人。當他們對膠原凝膠進行納米振動時，使用AFM來檢測剛度的任何變化。他們沒有觀察到凝膠內(nèi)應變硬化的顯著影響和楊氏模量保持軟膠原凝膠的值 ; 因此，將細胞分化歸因于單獨的納米振動。

TOP：納米振動過程中膠原凝膠的AFM測量。(A)將振動壓電致動器連接到含有膠原凝膠的培養(yǎng)皿上，AFM懸臂用于測量振動期間凝膠硬度的任何變化。(B)通過AFM評估在三種不同壓電振幅下納米振動的膠原樣品的楊氏模量。數(shù)據(jù)是平均值±SD(n> 30)。底部：納米振動刺激三周時的蛋白質(zhì)表達。以1kHz和30nm置換的頻率與未刺激的對照一起刺激細胞三周。相對于靜態(tài)對照測量RUNX2，OSX，OPN，OCN和ALP的蛋白質(zhì)表達，并使用LI-COR Odyssey系統(tǒng)(LI-COR，Nebraska，USA)定量。與未刺激的對照相比，在機械刺激的樣品中觀察到統(tǒng)計學上顯著更高的表達(由紅色虛線表示)。數(shù)據(jù)是平均值±標準差，n = 4，stats Mann Whitney U-檢驗* p <0.05。圖片來源：科學報告，doi：10.1038 / s41598-019-49422-4。

在納米振動期間，細胞經(jīng)歷分化以形成通過相對于骨發(fā)育適度上調(diào)基因而觀察到的成骨譜系。由于骨相關(guān)蛋白表達更多地是這種轉(zhuǎn)換的明確指標，科學家們測試了納米振動3周，刺激與未刺激的MSCs對已知的成骨相關(guān)蛋白表達。他們觀察了Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)，osterix(OSX)，骨橋蛋白(OPN)，骨鈣素(OCN)和堿性磷酸酶的表達(ALP)蛋白質(zhì)，與未刺激的對照相比。成骨分化的蛋白質(zhì)生物標志物的表達表明新設計的生物反應器成功刺激MSC成骨的能力。

通過這種方式，Paul Campsie及其同事開發(fā)了一種生物反應器系統(tǒng)，該系統(tǒng)在研究項目或小型臨床試驗的規(guī)模上發(fā)揮了充分的作用。該設備提供機械刺激，振幅接近30nm，頻率為1kHz。為了應對機械轉(zhuǎn)導對控制骨骼研究中細胞行為和干細胞分化的興趣日益增長，研究團隊對系統(tǒng)進行了優(yōu)化，以提供更廣泛的頻率范圍。這項新工作將開啟一個全新的機械生物學領(lǐng)域，通過'nanokicking刺激其他細胞類型具有無法預料的潛力“未來的工作將集中在改進的系統(tǒng)上，以便為更大量的細胞提供機械刺激。